基于热分析技术及综合评价的栀子炭炮制工艺
摘要：目的优化栀子炭炮制工艺，并结合药效学研究对所得炮制工艺进行验证。方法运用热分析技术分别对栀子中不同有效成分进行热解特性分析，得出栀子炭最佳炮制温度范围；同时，以栀子炭中鞣质含量为指标，选择炒制温度、炒制时间2个因素，结合响应面法试验优化栀子炭炮制工艺，并通过药效学实验（止血实验）对栀子炭炮制工艺进行验证。结果热分析实验综合分析得出栀子炭最佳炮制温度为.3～.0℃；响应面法优化得出栀子炭最优炮制工艺为炒制温度℃，炒制时间5.91min；与空白组比较，新法组、传统组均能极显著缩短小鼠凝血时间（P＜0.01），生品组能显著缩短小鼠凝血时间（P＜0.05）；新法组能显著缩短小鼠活化部分凝血活酶时间（APTT）（P＜0.05），对小鼠凝血酶原时间（PT）、凝血酶时间（TT）的影响差异不显著。结论结合热分析技术和响应面法优化栀子炭炮制工艺，并进行相关药效学实验验证，结果合理可行，该法可为改进传统中药炮制工艺，合理量化炮制过程中火力火候参数提供借鉴。
栀子入药始载于《神农本草经》[1]，为我国传统药食两用中药，药用栀子为茜草科植物栀子GardeniajasminoidesEllis的干燥成熟果实，具有泻火除烦、清利湿热、凉血解毒，外用消肿止痛之功效[2-3]。栀子古今炮制方法众多，清炒法（炒黄、炒焦、炒炭）、酒制、姜制等沿用至今[4-5]。传统中医药理论认为“血见黑止”，《十药神书注解》[6]中记载的“十灰散”以栀子等10味药材烧灰存性，研极细末得来，用于治痨症、呕血、吐血、咯血、嗽血等症。现代药理研究表明栀子炒炭后，寒性降低，止血功能增强，善于凉血止血，多用于吐血、咯血、衄血、尿血、崩漏下血等。
热分析技术是在程序控制温度下，测量物质的物理性质与温度关系的一类技术，广泛应用于塑料、橡胶、涂料、药品[7-8]、催化剂、无机材料等各个领域。本课题组已尝试将热分析技术应用于中药炮制现代研究中，应用热重（TG）/微商热重（DTG）技术模拟炮制过程，在量化中药炮制火力火候工艺参数方面做了相关研究[9-11]。本研究通过热分析技术对栀子中主要化学成分[12]总环烯醚萜类、总黄酮类和总有机酸类进行热解特性研究，并结合响应面法，以栀子炭中鞣质含量为指标进行工艺优化，同时对所得炮制工艺进行药效学实验验证，为建立栀子炭饮片质量标准及其规范化生产提供实验依据。
1仪器与材料
STA-F5型热重-差热同步热分析仪，德国耐驰公司；Spectrophotometer紫外可见分光光度计，上海美谱达仪器有限公司；ARCN分析天平，美国奥豪斯公司；ABL系列多功能炒药机，兰州阿泊罗电子设备有限公司，规格25L，投料量≥g；Start4半自动血凝仪，法国DiagnosticaStago公司。对照品没食子酸（批号，质量分数98%）、芦丁（批号，质量分数98%），成都普菲德生物技术有限公司；对照品栀子苷，批号MUST-，质量分数99.03%，成都曼斯特生物科技有限公司；磷钼钨酸，北京华科盛精细化工产品贸易有限公司，批号；无水碳酸钠，天津市科密欧化学试剂有限公司，批号；干酪素，上海麦克林生化科技有限公司，批号C；柠檬酸钠，天津市北辰方正试剂厂，批号；活化部分凝血活酶时间（APTT）试剂盒（批号）、凝血酶原时间（PT）试剂盒（批号）、凝血酶时间（TT）试剂盒（批号），上海太阳生物技术有限公司。栀子药材购于北京同仁堂（晋中分店），经山西中医药大学中药学院张朔生教授鉴定为茜草科植物栀子GardeniajasminoidesEllis的干燥成熟果实。雄性昆明种小鼠，体质量20～25g，由斯贝福（北京）生物技术有限公司提供，SPF级，合格证号20，生产许可证号SCXK（京）-。
2方法与结果
2.1热分析实验
2.1.1栀子药材粉末样品制备称取栀子药材g，粉碎，过40目筛，备用。
2.1.2栀子醇浸出物样品制备按《中国药典》年版四部通则制备栀子醇浸出物，蒸干溶剂，残渣研碎，过40目筛，即得。
2.1.3栀子总环烯醚萜类提取物样品制备[13]取10g栀子粉末，置圆底烧瓶中，加50%乙醇mL置水浴90℃回流提取1h，滤过收集滤液，浓缩挥干溶剂，残渣研碎，过40目筛，即得。精密称定所得粉末0.01g，以栀子苷为对照品，采用紫外分光光度法测定粉末中总环烯醚萜类化合物的质量分数为75.24%，回归方程为Y＝20.X＋0.，r2＝0.，线性范围为5.6～22.4μg/mL。
2.1.4栀子总有机酸提取物样品制备[14]取10g栀子粉末，置圆底烧瓶中，加70%乙醇70mL置水浴上95℃回流提取，滤过，提取3次，每次1.5h，合并滤液，并浓缩至相对密度1.05（60℃），浓盐酸调pH至2～3，加醋酸乙酯10mL萃取3次，减压回收醋酸乙酯，浓缩至稠膏，加适量乙醇溶解，滤过，挥干滤液，残渣研碎，过40目筛，即得。精密称定所得粉末0.01g，采用酸碱滴定法测定粉末中总有机酸质量分数为82.35%。
2.1.5栀子总黄酮提取物样品制备[15]称取10g栀子粉末，置圆底烧瓶中，加60%乙醇mL，80℃水浴回流提取2.5h，收集滤液，浓缩并挥干溶剂，残渣研碎，过40目筛，即得。精密称定粉末0.01g，以芦丁为对照品，采用紫外分光光度法测定粉末中总黄酮化合物的质量分数为77.54%，回归方程为Y＝1.X＋0.，r2＝0.，线性范围为0.04～0.20mg/mL。
2.1.6热分析实验以模拟空气（N2-O24∶1）为载气，升温速率为10℃/min，体积流量为60mL/min，分别取生栀子药材粉末、栀子醇浸出物、栀子总环烯醚萜类提取物、栀子总黄酮提取物、栀子总有机酸提取物等试样量（30±5）mg，水平均匀分散于坩埚中，在模拟空气的条件下对其进行热解特性的研究，从室温升至℃，每个样品平行2次实验。
2.1.7数据处理采用Origin8.0进行数据处理。
2.1.8热分析实验结果与分析栀子总环烯醚萜类、总黄酮类、总有机酸类提取物TG-DTG曲线见图1-A～C、浸出物TG-DTG曲线见图1-D，原药材TG-DTG曲线见图1-E，相关参数见表1。
对比总环烯醚萜类提取物燃烧热解特性可知，.7～.6℃阶段为主要热解阶段，热失重为34.71%，在.2℃时出现强度为4.87%/min的热解燃烧阶段热失重速率峰极值；由总黄酮类提取物燃烧热解特性可知，.1～.9℃阶段为主要热解阶段，热失重为48.89%，在.3℃时出现强度为5.22%/min的热解燃烧阶段热失重速率峰极值；对比总有机酸类提取物燃烧热解特性可知，87.8～.2℃阶段为主要热解阶段，热失重为54.73%，在.4℃时出现强度为3.36%/min的热解燃烧阶段热失重速率峰极值；对比栀子浸出物燃烧热解特性可知，.9～.0℃阶段为主要热解阶段，热失重为55.11%，在.1℃出现强度为4.26%/min的热解燃烧阶段热失重速率峰极值。总环烯醚萜类、总黄酮类提取物和浸出物均在～℃出现较强的热失重速率峰（图1-E、F）。对比生品热解燃烧特性曲线可知，.3～.4℃阶段热失重为16.16%，在传统武火炮制下，栀子中总环烯醚萜类、总黄酮类、总有机酸类成分含量大幅度降低，但并未消失，以此为依据，结合炮制适度理论可推测栀子炒炭温度起点为高于.3℃，结合栀子生品及浸出物TG-DTG曲线可知，栀子炒炭温度终点为不高于℃，由此可推测栀子炒炭最佳炮制温度为.3～.0℃。
2.2鞣质含量测定[16]
2.2.1线性关系考察以80%乙醇为溶剂配制质量浓度为92μg/mL的没食子酸对照品溶液。分别精密吸取没食子酸对照品溶液0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8mL于10mL量瓶，分别补水3.8、3.7、3.6、3.5、3.4、3.3、3.2mL，加入1mL磷钼钨酸试剂，摇匀后静置5min；再以10%碳酸钠溶液定容至刻度，摇匀，避光放置90min，以80%乙醇溶液作空白组，于nm波长处测定吸光度（A）值。以A值为纵坐标（Y），没食子酸质量浓度为横坐标（X），绘制标准曲线，进行线性回归，得回归方程为Y＝.61X－0.，r2＝0.，线性范围为1.84～7.36μg/mL。
2.2.2供试品溶液制备样品粉碎后过40目筛，取0.15g，精密称定后加入50mL80%乙醇溶液，30℃以下超声提取30min，取出放冷后称定质量，以80%乙醇补足损失质量，离心后滤过，滤液即为供试品溶液。
2.2.3测定方法
（1）总多酚的定量测定：取供试品溶液适量于10mL量瓶中，加水至4.0mL，先加入1mL磷钼钨酸试剂，摇匀，静置5min，再以10%碳酸钠溶液定容至刻度，摇匀，避光放置90min，以试剂作空白组，测定其在nm波长处的A值，按“2.2.1”项标准曲线计算所测样品中总多酚的质量浓度，计算栀子炭中总多酚量。
（2）不被吸附多酚的定量测定：取供试品溶液适量，按0.05g/mL加入干酪素，30℃水浴30min，时时振摇。水浴后离心、滤过，按总多酚定量测定方法，以加入干酪素的试剂作空白组，测定其在nm波长处的A值。按“2.2.1”项标准曲线计算所测样品中不被吸附多酚的质量浓度，所得结果为不被吸附多酚量。
（3）鞣质的定量测定：根据《中国药典》年版四部通则中计算鞣质含量公式得到。
鞣质的量＝总多酚量－不被吸附多酚量
2.2.4精密度试验精密吸取响应面试验2号样品溶液0.15mL，采用“2.2.3”项方法测定A值，连续6次，RSD为0.13%，表明仪器精密度良好。
2.2.5稳定性试验精密吸取响应面试验2号样品溶液0.15mL，按“2.2.3”项方法于30、60、90、、、min测定A值，min内A值较为稳定，RSD为1.06%。
2.2.6重复性试验取响应面试验2号样品，依“2.2.2”项下供试品溶液制备方法，分别平行制样6份。分别精密取溶液0.15mL，按“2.2.3”项方法测定鞣质的量，平行试验6次，得其RSD为1.22%，表明该方法重复性良好。
2.2.7加样回收试验精密称取响应面试验2号样品9份，每份0.15g，分别按样品总多酚量的50%（3份）、%（3份）和%（3份），精密加入没食子酸对照品。按“2.2.3”项方法测量没食子酸的量，计算得没食子酸平均回收率为.4%，RSD为2.12%，表明加样回收率良好。
2.3单因素实验考察栀子炒炭炮制工艺
2.3.1炒制温度对栀子炭炮制工艺的影响取栀子碎块5份，每份g，置炒药机内，在温度为、、、、℃下炒制5min，取出晾凉，即得栀子炭饮片。将制备好的栀子炭按照“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，然后按照“2.2.3”项下方法测定鞣质质量分数分别为1.、1.、2.、1.、0.mg/g。炒制温度为℃时鞣质含量最高，因此选取℃为最佳。
2.3.2炒制时间对栀子炭炮制工艺的影响取栀子碎块5份，每份g，置炒药机内，在温度为℃下分别炒制4、5、6、7、8min，取出晾凉，即得栀子炭饮片。将制备好的栀子炭按照“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，然后按照“2.2.3”项下方法测定鞣质质量分数分别为2.、2.、2.、2.、1.mg/g。炒制时间为6min时鞣质质量分数最高，因此选取6min为最佳。
2.4响应曲面试验法优化栀子炒炭炮制工艺
2.4.1试验设计与结果根据单因素实验结果，选择炒制温度（A）、炒制时间（B）2个因素作为响应变量，利用DesignExpert8.0.6软件按照中心组合（复合）设计（CCD）原理，以栀子炭中鞣质含量（Y）为响应值，通过响应面分析进行炮制工艺的优化，得到栀子炭最优炮制条件，因素水平及响应面试验设计与结果见表2。
2.4.2试验分析由三维的立体模型图以及实验结果得到的相应的2次方程模型：鞣质含量＝3.14－0.A－0.B－0.19AB－0.50A2－0.38B2。r2＝0.，说明该模型能解释92.59%响应值的变化，因此该模型的拟合程度较好，试验误差小，可以用此模型进行分析和预测。响应面结果的方差分析见表3，各因素对于栀子炭中鞣质质量分数的影响大小为炒制时间＞炒制温度。
2.4.3响应面试验结果根据所得模型绘制炒制温度、炒制时间的交互作用对栀子炭炮制工艺影响的3D响应面图见图2。由Design-Export8.0.6优化处理得到最佳栀子炭炮制工艺参数为炒制温度为.94℃，炒制时间为5.91min，预测鞣质质量分数为3.mg/g。
2.4.4工艺结果验证根据软件得出最优结果，结合实际操作，将栀子炭炮制最佳工艺调整为炒制温度为℃，炒制时间为5.91min，按此工艺条件重复3次实验，结果3次实验鞣质质量分数分别为3.、3.、3.mg/g，得到鞣质平均质量分数为3.mg/g，与预测值相接近，说明利用响应曲面法对炮制工艺拟合效果较好。
2.5最优工艺炮制栀子炭的药效学实验验证
2.5.1样品制备按照响应面法优化得出的最佳工艺炮制栀子炭，即得新法炮制样品；取栀子生品碎块适量，置炒制容器内，用武火加热，炒至黑褐色，喷淋少许清水熄灭火星，取出晾干[17]，即得传统法炮制样品。分别取新法炮制栀子炭样品、传统炮制栀子炭样品和同批次栀子生品饮片制备成生药质量浓度为1g/mL的水煎液备用。
2.5.2分组与给药[18]取雄性昆明种小鼠48只，随机分为4组：空白组、新法炮制组、传统炮制组、生品组，每天ig给药1次，给药剂量为生栀子组0.g/g、新法炮制组0.g/g、传统炮制组0.g/g，连续给药3d。
2.5.3凝血时间测定于末次给药1h后，摘眼球采血，丢弃第1滴血，然后在洁净载玻片滴1滴直径8mm左右的血滴，开始计时，每隔30s用大头针从血滴边缘向中间轻挑1次，直至能挑起丝状纤维蛋白停止，即为凝血时间。
2.5.4APTT、PT、TT测定于末次给药后1h后，摘眼球取血，弃去第1滴血，取0.9mL血液加入含0.1mL3.8%枸缘酸钠的Eppendorf管中，混合均匀，0r/min离心15min，收集上层血浆，在2h内血凝仪测定内/外源性凝血功能指标（APTT、PT、TT）。
2.5.5统计学方法采用SPSS22.0统计软件进行数据分析，计量资料用表示。
2.5.6对凝血时间的影响与空白组比较，新法炮制组、传统炮制组均能极显著缩短小鼠凝血时间（P＜0.01），生品组能显著缩短小鼠凝血时间（P＜0.05），新法炮制组效果好于传统炮制组，但2组比较无明显差异，结果见表4。
2.5.7对小鼠APTT、PT、TT的影响与空白组比较，新法炮制组可以显著缩短小鼠APTT（P＜0.05），传统炮制组和生品组差异不显著，传统炮制组仅有缩短趋势，2组相比无明显差异；与空白组比较，对于小鼠PT、TT的作用，新法炮制组、传统炮制组和生品组均无明显差异，结果见表4。
3讨论
中药炮制是一门传统的制药技术，目前多数中药的炮制原理尚未阐明，炮制工艺大多延续古法，故对中药炮制工艺研究的深度和广度受到很大影响。目前，热分析技术已开始应用于中药炮制研究领域[19-20]，本实验参照有关文献对栀子总环烯醚萜类、总黄酮类和总有机酸类等样品进行制备，并采用热分析技术模拟其热解过程，虽然总环烯醚萜类和总黄酮类提取物制备工艺类似，但热分析实验结果发现温度升高到℃左右时，栀子总环烯醚萜类和总黄酮类样品均首次出现较大热失重速率峰，但前者明显高于后者。关于国内炭药止血原理的研究，大多认为炭药止血可能与炒炭后鞣质、Ca2+、炭素含量增加或与其他成分的产生有关[21-23]，根据相关研究报道[24-26]多数药材炒炭后鞣质含量增加，如茜草、茅根、地榆、藕节等炒炭后鞣质含量增加2～4倍，鞣质类成分耐热性能良好，故本实验选择鞣质含量为工艺优化指标，研究过程中除了测定栀子炭样品中鞣质含量，同时也对同批次栀子生品鞣质含量进行测定，鞣质质量分数为2.mg/g，含量低于大部分炒炭样品。
本研究对最优工艺下炮制的栀子炭样品进行止血药效验证，结果表明栀子炭新法炮制品和传统炮制品与生品相比均能显著缩短小鼠凝血时间，原因可能是生品中也含有鞣质类成分和其他止血物质，只是含量低于栀子炭。从实验数据看，各组对小鼠APTT、PT、TT的影响差异不是很明显，新法炮制组可以缩短小鼠APTT，差异也是仅具有统计学意义。分析原因可能是栀子炭单味药止血作用与传统止血药地榆、茜草等相比差很多，也可能并不局限于止血，因此后续可以采用其他药效模型进行研究，从凉血止血角度，建立血热出血模型[27]，进一步揭示栀子炭炮制机制。
规范中药饮片及其炮制品生产工艺以及制定相关质量标准是中药可持续发展的基础。运用热分析技术和响应面法相结合优化中药炮制工艺，量化火力火候参数，并进行相关药效验证，使研究更加客观化、具体化、数字化。与传统炮制相比，新法炮制工艺炮制出的样品质量稳定，利于质量标准的建立。结合新的技术，揭示炮制机制，改进炮制工艺，为今后将研究成果应用于中药饮片实际生产中提供可靠的理论依据。
参考文献（略）来源：吕辰子，张晓燕，苏晓娟，宁晨旭，王勃，孟祥龙，张朔生.基于热分析技术及综合评价的栀子炭炮制工艺研究[J].中草药,2,50(21):-.预览时标签不可点收录于话题#个上一篇下一篇转载请注明：http://www.sunyijia888.com/csjd/6094.html
