基于ldquo表里关联rdquo

摘要：目的研究大黄炭炮制过程颜色特征与化学成分的关联性规律，为建立基于颜色量化值的大黄炭炮制过程控制方法和终点判断标准奠定基础。方法分别在不同温度和时间下制备大黄炭样品，以大黄炭炮制的经验判断为依据，利用视觉分析仪与紫外-可见光谱仪量化大黄炭不同炮制条件的粉末和饮片颜色。同时采用HPLC指纹图谱的方法评价大黄炭炮制过程中化学成分动态变化，利用多元统计学方法对大黄炭炮制过程样品颜色量化值与特征成分进行关联分析。结果在大黄炭炮制过程中，随着炭化程度的增大，样品表观颜色由淡黄棕色逐渐加深至焦黑色，样品饮片和粉末的明度值（L*）、红绿色值（a*）、黄蓝色值（b*）之间高度相关。HPLC指纹图谱上26个特征峰的面积与色度值均有不同程度的相关性，其中随炭化程度加深而含量递减的5个结合蒽醌类成分（芦荟大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黄酸-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黄酚-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黄素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷）和2个番泻苷类成分（番泻苷A、番泻苷B）与色度值呈线性相关关系，含量先增后减的5个游离蒽醌类成分（芦荟大黄素、大黄酸、大黄酚、大黄素、大黄素甲醚）、没食子酸和5-羟甲基糠醛（5-HMF）与色度值呈二次相关关系。结论大黄炭炮制过程中的颜色主观判断与量化检测的分析结果一致，颜色量化值与14种已知化学成分的含量具有显著的相关性，初步推断颜色量化值可作为大黄炭炮制过程的质量控制和终点判定指标，以提高大黄炭饮片的质量水平及其一致性。

大黄为蓼科（Polygonaceae）植物掌叶大黄RheumpalmatumL.、唐古特大黄R.tanguticumMaxim.exBalf.和药用大黄R.officinaleBaill.的根和根茎。大黄记载于《神农本草经》，为临床常用泻下药，用于治疗大便秘结、淤血经闭、目赤肿痛、血热吐衄等症，同时经炮制后也用于其他疾病。大黄的炮制品种类繁多[1]，临床上常用的有酒大黄、熟大黄、大黄炭等，其中大黄经炭制后泻下作用微弱，以凉血、化瘀止血为主，临床上多用于治疗消化性溃疡、慢性肾功能衰竭、胃部等炎症性疾病。现代研究表明[2]，经炮制后的大黄其性味、化学成分会发生相应的变化，而具有不同的药理作用[3]。

“炒炭存性”是传统的中药制炭的质量要求，但缺乏量化指标；而炭药炮制前后化学成分变化复杂，也是其临床不同应用的物质基础，加强该方面的研究对于炭药炮制工艺及其炮制品质量控制具有重要的意义。在传统中药研究中，随着测量技术及色差分析仪器的发展，色差分析技术应用越来越广泛。部分学者将该测定技术引入中药领域，实现了对中药材、中药饮片及其粉末颜色的客观量化[4-6]，为中药饮片的炮制程度及其质量控制提供技术支持和借鉴[7]。目前，应用视觉分析仪客观量化饮片表征，进一步研究其表征与指标性成分之间的关联性报道逐渐增多[8-11]，但研究其表征与HPLC指纹图谱变化的动态关联性报道较少[6]。此类研究把中药饮片的直观性及经验性鉴别转化为标准客观化数据，具有明显的可行性及参考价值。

本课题组前期研究发现大黄炭炮制过程的颜色变化与蒽醌类等重要活性成分可能具有一定的内在关联[12]，因此本研究进一步通过多元统计的方法挖掘大黄炭的颜色与化学成分的具体关系，为建立基于颜色量化值的炮制过程控制和终点判断标准奠定基础。

1仪器与样品

1.1仪器和设备

DHG-C烘箱，上海培因实验仪器有限公司；BJ-A拜尔多功能粉碎机、BT-25S电子分析天平，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；KHDB型数控超声波清洗器，昆山超声仪器有限公司；CM-5型分光色测仪，日本柯尼卡美能达公司；UV-Vis-NIR紫外-可见-近红外分光光度计，珀金埃尔默企业管理（上海）有限公司。

1.2样品收集与鉴定

原药材采集于甘肃省甘南州卓尼县，采集前均经过厂家阴干处理。经中国中药协会首席科学家张世臣教授鉴定为蓼科植物唐古特大黄RheumtanguticumMaxim.exBalf.的干燥根和根茎。

2方法与结果

2.1大黄炭饮片制备

参照北京市中药饮片炮制规范（）“取大黄片，用武火～℃炒至表面焦黑色、内部焦褐色”的规定进行样品的前处理。为减少样品内部水分量不受温度和湿度的影响，在同一天之内进行了所有条件下大黄炭的烘烤。加热前先测量样品的直径在4.0～7.0cm不等，厚度在0.3～0.5cm。取同一批次18份大黄原药材35g平铺于不锈钢圆盘中使其受热均匀，分别用实验室烘箱在、、℃的温度下烘烤10～60min获得不同的药材，另取1份不经加热的原药材与加热样品作以对比。最后根据专家经验鉴别加热后样品的表面和断面颜色判断其炭化的程度，其中样品处理后的表观颜色如图1所示。

2.2大黄炭饮片表面色度值测定

运用UV-Vis-NIR反射光谱仪，以mm插入式积分球附件（8°反射角，InGaAs检测器），块状样品直接置于积分球反射测量窗口。光谱扫描范围～nm，狭缝宽度2nm或4nm，数据点间隔1nm或2nm，积分时间1s，根据样品最高吸光度调节参比光束衰减值，使用Spectralon参考白板进行光谱背景校正，校正结束后将不同炮制条件的大黄炭饮片放入测量仪中，变换位置，平行3次拍照，计录样品颜色的L*、a*、b*值。其中L*表示明度，a*和b*表示不同的色调方向。L*值越大明度越大，色泽越白；反之越暗。a*表示红绿方向，＋a*表示红方向，?a*表示绿方向。b*表示黄蓝方向，＋b*表示黄方向，?b*表示蓝方向。

2.3大黄炭粉末色度值测定

将紫外可见分光光度计起止波长设为～nm；扫描速度设为60nm/min；狭缝宽度设为1nm；照明光源设为D65；视场选择10°视角进行测量。测量时按设定的条件进行基线校正操作，将标准白板分别放入色度测量仪中积分球的参比和样品处进行校正，校正完成后取出样品处的标准白板，取适量大黄炭炮制过程样品粉末（过五号筛）压制于石英测色皿中（以装满测色皿为基准），压制厚度约为1mm，盖上石英玻璃片，用封口膜封口以防粉末漏出。然后将石英玻璃片与石英皿外侧用擦镜纸擦拭干净放入测量仪中进行测量，变换位置，平行3次拍照，计录样品颜色的L*、a*、b*数值。得到大黄炭的饮片和色度测定结果如表1所示，由表可知，相对于炒制零点，大黄炭炮制过程中，样品饮片和粉末颜色L*、a*、b*、总色值（E*ab）都呈下降趋势，表明样品表观颜色变深，亮度由明至暗。大黄炭炮制过程中，以大黄炭粉末为例，在℃加热10min与初始饮片色差值E*ab大于10，随着后期加热温度和时间的升高，E*ab值逐渐降低。当E*ab值为7～14、19～34、41～48个色差单位（NBS）时，样品色差可被肉眼识别，因此大黄炭炮制过程样品外观和断面的颜色变化可被肉眼明显识别。

2.4大黄炭HPLC指纹图谱与成分含量测定

大黄炭样品的HPLC指纹图谱与14种化学成分含量测定方法和结果，见本课题组已发表的文献报道[13]。

2.5大黄炭HPLC指纹图谱与色度的灰色关联度分析

基于大黄炭各样品指纹图谱的动态分析，将大黄炭的色度L*、a*、b*、E*ab值与大黄炭样品中共有成分进行灰色关联度分析。分别以L*、a*、b*、E*ab值为参考序列，以成分共有峰的峰面积为比较序列，对于参考数列X0有若干个比较数列X1，X2，……，Xn，各比较数列与参考数列的关联系数ξi(k),可由ξi(k)＝[Δmin＋ρΔmax]/[Δ0i(k)＋ρΔmax]算出，其中ρ为分辨系数，一般在0～1，通常取0.5；Δ0i(k)表示比较数列与参考序列的绝对差；Δmin和Δmax分别表示所有比较序列绝对差中的最小值与最大值。比较序列Xi对参考序列X0的灰关联度计算公式为，式中n为共有峰的数量。

3结果与讨论

3.1不同炮制程度大黄炭饮片与粉末颜色量化分析

将19个样品的饮片和粉末颜色量化结果导入JMP10.0软件进行多元统计分析（表2）。由相关性分析结果可知，大黄炭饮片与粉末、饮片与饮片、粉末与粉末之间的L*、a*、b*值两两均呈正相关关系，即随着炮制程度的加深，大黄炭饮片与粉末的明度、红色程度、黄色程度均呈相同的下降趋势；大黄炭饮片和粉末的E*ab之间亦呈正相关关系，表明饮片和粉末的颜色变化都可反映大黄炭的炮制颜色的变化程度。而大黄炭饮片与粉末的总色值E*ab与各自色L*、a*、b*之间呈负相关关系，说明大黄炭颜色的总色值随着炮制过程中的明度、红色、黄色的下降而上升。

3.2基于粉末颜色的大黄炭炮制程度评价

因大黄炭饮片和粉末的色度值呈现极显著相关性，且粉末的颜色变化较饮片均一，以大黄炭粉末的色度为例进行如下统计分析：将19个样品粉末颜色色号结果导入SIMCA-P13.0软件进行分组分析（图2）。由分析结果可知，大黄炭加热过程中样品可分为3个组别，即A、B和C。A组样品为℃加热10～50min、℃加热10～20min、℃加热10min，粉末L*、a*、b*和E*ab值分别在42～61、9～12、24～40、50～74；B组样品为℃加热60min、℃加热30～60min、℃加热20min，L*、a*、b*和E*ab分别在29～62、7～9、10～22、35～48；C组样品为℃加热30～60min，L*、a*、b*和E*ab分别在25～28、4～5、3～6、26～29。

结合传统经验鉴别的分析可知，C组℃加热40min的样品方可达到大黄炭“表面焦黑色、内部焦褐色”性状要求，对应L*、a*、b*和E*ab分别为25.48、5.38、5.37、26.59。由3个组别的色度范围可知，L*值在任一组内的变化幅度最大，b*次之，a*变化最小，总色度E*ab的范围即主要由明度L*值的变化决定。色度变化结果说明在大黄炭炮制过程中的颜色主要是由明到暗的变化，样品的总色度值也是由大黄炭明度值减小的程度所决定。由于饮片的外观颜色总是先于内部颜色变化，故饮片L*、a*和b*总是较粉末的值低，而无论是测定饮片还是粉末的色度，理论上二者都可在一定程度上监测大黄炭的炮制过程。鉴于在实际生产中，大黄炭饮片的表观颜色受炮制过程的受热面积、检测区域等的影响，不能很好的反映大黄炭饮片的颜色变化情况，而大黄炭粉末具有良好的均一性和稳定性，所以检测粉末的色度更能客观的控制大黄炭的炮制过程。此外。因本研究对于大黄炭的加热方式与传统方式不同，因此符合传统性状的色度范围还需结合大黄炭炮制饮片的实际生产进行实时监测。

3.3大黄炭HPLC指纹图谱与色度的灰色关联度分析结果

将19批样品色谱图导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（版）”，设置大黄原药材色谱图为参照图谱，平均数法生成对照图谱，进行多点校正和色谱峰匹配，生成叠加图谱，见图3-a。由图3-a可知各共有峰较稳定，具有指纹图谱特征性，可初步认定为大黄原药材与大黄炭的指标成分群。最终确定26个大黄原药材和炮制品的共有峰，峰2为加热后新生成的物质5-羟甲基糠醛（5-HMF）[14]，为炮制品的共有峰。通过与对照品（图3-b）比对，指认其中14个成分，峰1～14分别为没食子酸、5-HMF、芦荟大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷、番泻苷B、大黄酸-8-O-β-D-葡萄糖苷、番泻苷A、大黄酚-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黄素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚；峰a～m为未知成分。

根据大黄炭粉末色度L*、a*、b*、E*ab与27个特征峰进行灰色关联度分析（表3）发现，大黄酸-8-O-β-D-葡萄糖苷与L*、a*、b*值的相关度最大，分别为0.、0.、0.，与E*ab相关度最大的为番泻苷A。以L*、a*、b*、E*ab均大于0.7的关联度视为色度和成分具有较强关联性，由结果可知具有较强关联性的分别有大黄酸-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黄素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷、芦荟大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷、番泻苷A和峰l、a、j、k、b、e、d、f、c。除峰m外其他成分番泻苷B、大黄酚-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黄素甲醚等均与色度值也具有一定相关性，结果初步表明大黄炭的各色度值与成分含量具有不同程度的相关性。

3.4大黄炭主要化学成分与色度的关联形式分析

将炮制过程样品粉末颜色的色值与HPLC指纹图谱中已知化学成分的含量结果[13]，分别输入SPSS23.0软件进行Pearson相关性分析（表4），结果显示，与L*、a*、b*、E*ab变化呈线性相关的化学成1-没食子酸2-5-HMF3-芦荟大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷4-番泻苷B5-大黄酸-8-O-β-D-葡萄糖苷6-番泻苷A7-大黄酚-8-O-β-D-葡萄糖苷8-大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷9-大黄素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷10-芦荟大黄素11-大黄酸12-大黄素13-大黄酚14-大黄素甲醚分为番泻苷A、番泻苷B、芦荟大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黄酸-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黄酚-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黄素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷。各色度值与没食子酸、5-HMF、大黄酸、大黄酚、芦荟大黄素、大黄素和大黄素甲醚无线性相关性。表明大黄炭炮制过程中，结合蒽醌和番泻苷含量随颜色加深逐渐降低，而没食子酸、5-HMF和游离蒽醌含量则与表征颜色加深的色度值之间无线性相关性。

基于已知化学成分与总色度值之间的相关性分析结果，首先将没食子酸等7个与色度值之间无线性相关性的成分含量进行二次相关性分析。以大黄炭粉末的色度E*ab值为例，通过软件JMP10.0作与总色值E*ab值无显著相关性成分含量之间的非线性二次拟合模型，发现成分与色度之间具有二次相关性，同时作与色度值具有极显著相关性成分含量之间的线性拟合模型，14个成分变化趋势和拟合函数如图4所示。

由图4可知，总色值E*ab随着结合蒽醌和番泻苷含量的减少呈下降趋势，且E*ab与各成分之间呈不同斜率、不同截距的线性函数变化关系；E*ab随着游离蒽醌、没食子酸和5-HMF含量先增加后减少的趋势亦呈下降趋势，二者之间呈二次函数变化关系（E*ab范围为26～74，各化学成分线性范围见已发表文献报道[13]）。由此推断，在生产中通过实时动态检测大黄炭炮制过程中的色度变化，可初步预测大黄炭中有效成分的含量变化情况，进而确定大黄炭的最佳炮制终点。

4小结

传统上，监测中药炮制过程及炮制终点时，主要参考指标为饮片颜色及表观性状，且大多依靠老药工的经验鉴别及直观判断，主观性较强，缺乏客观的量化标准[15-17]。由于样品颜色量化值能客观、准确的体现大黄炭炮制过程中的颜色动态变化，因此本实验采用样品饮片和粉末为研究对象，采用现代分析仪器对大黄炭炮制过程样品传统主观性描述的表观颜色进行数据化表达，更具客观性。由色差分析结果可知，随着大黄炭炮制过程的加深，样品粉末颜色逐渐加深，L*、a*、b*、E*ab值逐渐降低，粉末颜色呈由淡黄棕色至焦黑色变化的规律，其炮制程度可以被肉眼识别，与炮制程度的传统性状鉴别结果一致。因此，将主观化经验判定的外观颜色描述转化为客观的数据标准，可在炮制过程中实时动态检测大黄炭的质量变化，对于大黄炭炮制过程的质量控制具有显著高效性和实用性。在实际生产过程中，由于国家、各省市、各企业之间的炮制温度、时间和取样量等条件不一，因此还需结合具体设定的炮制参数，进而确定炮制终点最佳的色度范围，以期确定大黄炭炮制达到“炒炭存性”时颜色的量化标准。本研究也为中药炮制过程监控及质量控制研究提供新思路，为传统中药炮制的现代化发展及科学技术的实际应用提供一种新的参考。

本实验在传统中医药理论思想的指导下，基于大黄炭炮制过程中“表里关联”的新思路，测定了大黄炭炮制不同时间和温度下的饮片和粉末色度的变化，并结合大黄炭的主要化学成分进行了大黄炭炮制过程中质量的多元统计分析。“表里关联”结果表明大黄炭饮片和粉末之间的L*、a*、b*值大小有所不同但变化趋势一致，且两两之间均有显著相关性。而样品粉末颜色特征较饮片颜色均一，色差结果较理想且重现性较好，所以本研究选用粉末代替饮片的色度值与已知成分含量进行关联性分析。在化学成分方面，本研究中纳入的结合蒽醌、番泻苷A和番泻苷B是大黄泻下的关键物质[18-19]，游离蒽醌和没食子酸为大黄炭主要止血化瘀的成分[20-22]，说明本研究选用的化学成分与大黄炭的药效具有紧密相关性。最终色度和化学成分含量的关联结果表明色度值与番泻苷A、番泻苷B、芦荟大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黄酸-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黄酚-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黄素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷之间具有线性相关性。色度值与没食子酸、5-HMF、大黄酸、大黄酚、芦荟大黄素、大黄素和大黄素甲醚具有二次相关性，且各成分含量与色度值之间具有明确的函数关系。结果中呈现出的线性相关性和二次相关性这两种函数的变化关系，是在大黄炭炮制过程中，色度值逐渐下降，成分结合蒽醌、番泻苷A和番泻苷B含量也呈下降趋势，所以二者具线性正相关关系。而游离蒽醌、没食子酸和5-HMF含量随着色度值的下降呈先上升后下降的变化趋势，因此二者之间呈二次相关关系。最后本研究认为在实际生产中可根据色度值的变化范围预测结合蒽醌、番泻苷、游离蒽醌和没食子酸等活性成分的含量，以实现大黄炭炮制质量的控制，进而确定大黄炭的最佳炮制终点。然而，颜色与药效水平的关系还需进一步的实验验证，以期为大黄炭质量评价提供更全面的数据支撑。

参考文献（略）

来源：杨丽，龚燚婷，许铭珊，杨乐，陈建波，董玲．基于“表里关联”的大黄炭炮制过程颜色和成分变化关系研究[J].中草药,,51(22):-.

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